肽分析反相色譜柱在分離中有什么作用

更新時(shí)間：2019-05-28

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肽分析反相色譜柱能夠拓寬從蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用到肽圖分析應(yīng)用的pH范圍，同時(shí)提供出色的溫度穩(wěn)定性。肽分析反相色譜柱填料表面帶少量正電荷，可與含TFA的標(biāo)準(zhǔn)洗脫液或弱酸性改性劑（如甲酸）一起使用，分析人員無需在可獲得清晰峰形的反相洗脫液與能夠避免MS信號減弱的洗脫液之間折衷。

通過氯硅烷把疏水相鍵合到硅膠基質(zhì)上就形成了反相HPLC吸附劑，這些硅膠基質(zhì)分子上有一個能附著疏水基團(tuán)的活性氯基。形成疏水相的烴基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的線性脂肪族烴。烴鏈的長度在蛋白質(zhì)分離效果上一般沒有什么不同。對于肽和少于5000道爾頓的小分子蛋白質(zhì)選用C18色譜柱。小的分子和親水的肽通常在小孔的C18柱子上分離得較好。大于5000道爾頓的蛋白質(zhì)或小分子多肽非常疏水，選用C4色譜柱。C8柱與C18色譜柱的應(yīng)用差不多，但分離個別肽時(shí)有時(shí)表現(xiàn)出不同的選擇性和分離能力。苯基柱沒有C4柱子那么疏水，所以對有些多肽表現(xiàn)出*的選擇性。反相表面的細(xì)微差別有時(shí)會造成RP-HPLC對多肽選擇性的不同，可以利用這一點(diǎn)來優(yōu)化特定肽的分離。

不同的反相吸附劑在分離蛋白質(zhì)酶消化物中的肽碎片時(shí)可能表現(xiàn)出不同的選擇性。用兩種RP-HPLC色譜柱分離β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片，結(jié)果表明不同的相有時(shí)對肽的反相分離具有微小的影響。與通常使用的C18色譜柱相比，C4柱的保留時(shí)間稍短，肽碎片洗脫圖形也有某些程度上的不同。測試不同的色譜柱是確定哪個柱子分離度的實(shí)用方法。有些實(shí)驗(yàn)室利用肽分析反相色譜柱的選擇性差異來進(jìn)行肽的二維分離。

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